多年来,植物抗虫基因工程的研究引起国内外农业专家的普遍关注,而且这种新的基因转移技术,可使目的基因从各种不同生物体导入其他性状优良的作物品种,克服了种问不亲和性,且能缩短育种年限,为植物虫害防治开辟新的途径。
一、利用苏云金杆菌杀虫晶体蛋白基因
苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)是一种致病性很强的昆虫病原菌,可以感染多种昆虫。它属于革兰氏阳性土壤芽孢杆菌,其杀虫活性主要靠杀虫晶体蛋白(1CP)或(-内毒素,存在于苏云金杆菌芽孢形成过程中所产生的伴孢晶体内,具有高度杀虫特异性。伴孢晶体随着昆虫摄食进入虫子消化道,释放出分于量为65一 160KD的原毒素,此时无活性,在昆虫中肠碱性环境下,原毒素被胃蛋白酶水解,C末端被切除,水解后形成分子量为60一70KD的括性多肽,这种活性多肽就可以与敏感昆虫肠道上皮细胞表面的特异受体相互作用,引起细胞膜穿孔,细胞因此肿胀甚至裂解,昆虫因拒食而饿死。另外一些研究表明,BT毒蛋白还能麻痹昆虫的神经系统,导致昆虫死亡。
世界上首例转BT基因的工程植株是1987年在比利时Montagu实验室获得的。他们使用全长的和3’端缺失的cryIA(b)基因,构建在甘露碱合成酶基因启动于的下游,转化烟草,实现了外源BT基因在烟草中的有效表达,虫试表明对一龄烟草天蛾有明显毒杀作用。第二十成功例于是由孟山都公司用BT毒蛋白基因在CaMV 35S启动子控制下。使转基因番茄产生了抗烟草天蛾的能力。
以上研究均用饲喂烟草天蛾幼虫来检测转基因植株的杀虫活性,虽然在实验室条件下发现某些转基因植株对烟草天蛾有杀虫活性,但却很难检测到BT基因毒蛋白产物,这显然是由于外源BT基因在植物细胞中表达量过低而引起。针对这一问题,Murray等人进行了系统研究,得出BT基因低表达主要原因是其:mRNA 不稳定及翻译效率低。为改变这一状况,美国盂山都公司的研究人员在不改变BT基因氨基酸序列的情况下,对 cryIA进行大规模修饰,改变了21%的核苷酸序列,增加了植物偏爱密码子,消除时对BT基因高表达的不利因素,再用改造后的BT基因转化烟草、番茄、棉花,实验证明,BT基因的表达量有明显提高,并获得了良好抗虫效果。
二、利用蛋白酶抑制剂基因
蛋白酶抑制剂(Proteinase 1nhibitor,pI)入白然界中丰富蛋白种类之一,尤其在豆科和茄科植物中,大多存在于储藏器官。蛋白酶抑制剂的杀虫机理在于:它能与昆虫消化道内蛋白酶结合,形成酶·抑制剂复合物,阻断或减弱了蛋白酶活性,这样昆虫摄入的外来蛋白就不能有效消化,干扰了正常代谢过程;同时,蛋自酶抑制剂和消化酶的结合,还会刺激消化腺的过量分泌,通过神经系统反馈,使昆虫产生厌食反应,最终导致昆虫正常发育或死亡。
迄今为止,在植物中发现有三类蛋白酶抑制剂:丝氨酸蛋白酶抑制剂、琉基蛋白酶抑制剂和金属蛋白酶抑制剂。与抗虫关系最密切的是丝氨酸蛋白酶抑制剂:目前,已有多种蛋白酶抑制剂基因或cDNA被克隆,并得到一批转蛋白酶抑制剂工程植株,转基因植株表现出良好抗虫效果,具有明显的应用前景。
1.豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(Cowpea Trypsin 1nhibitor,CpTI)该基因编码的是一类抗虫效果比较理想的蛋白酶抑制剂,主要存在于成熟豇豆中。CpTI的优点在于其抗虫谱广泛,几乎覆盖给农业造成重大经济损失的害虫。 Hilder等和刘春明等1987年分离并克隆了CpT1的cDNA,并获得了转CpT1基因的烟草植株,Souhern杂交证明该基因整合到烟草基因组中,Western杂交结果证明CpT1实现了在转基因烟草中表达,且表达量与抗虫性成正相关。另外,还有C1)TI转白薯、杨树的报道。
2.马铃薯蛋白酶抑制剂-II基因(Potato Proteinase lnhlbitor II,PL-II)在马铃薯中有一类具有损伤诱导功能的蛋白酶抑制剂,当该植物受到害虫攻击或机械损伤时,叶组织中能诱导表达一系列的蛋白物,其主要成分就是蛋白酶抑制剂,在番茄中也有类似现象。
3.慈菇蛋白酶抑制剂基因(Arrowhead proteinase inhibitor)慈菇块茎中富含蛋白酶抑制剂,蛋白酶抑制剂A和B,它们对胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶都有不同程度的抑制作用。目前这两种抑制剂的基因及其cDNA均用PCR 方法克隆得到,慈菇蛋白酶抑制剂基因转化烟草和杨树的工作正在进行中。
4.水稻巯基圣白酶抑制剂基因(Oryzacystatin) 水稻巯基蛋白酶抑制剂抗虫谱与CpTI抗虫谱具有互补性。日本东京大学、美国堪萨斯州大学都克隆到了水稻巯基蛋白酶抑制剂cDNA,并进行了测序。
蛋白酶抑制剂基因作为一种比较理想的抗虫基因,这是与其本身特点分不开的。首先从杀虫机理上看,其基因产物作用于昆虫消化酶的活性中心,这是酶的最保守部位,突变的可能性极小,基本可以排除害虫通过突变产生抗性的可能;其次,蛋自酶抑制剂的抗虫谱广泛;另外,蛋白酶抑制剂来源于植物本身,对人畜无害。但是蛋白酶抑制剂基因要想达到理想的抗虫效果,在转基因植株中的表达量要远远高于转BT基因植株的表达量,这给抗虫基因工程带来一定的困难。
三、利用外源凝集素基因
外源凝集素(1ectin)是一类非免疫来源的糖蛋白或能结合糖的蛋白质,在自然界中分布很广,多种生物中均有发现,豆科和禾本科植物中含量尤为丰富。它能特异识别并可逆结合糖类复合物而下改变被识别糖基共价结构。外源凝集素主要储存于植物细胞蛋白粒中,一旦被害虫摄食,在昆虫的消化道中释放出来,并与肠道围食膜上的糖蛋白结合,影响营养物质的正常吸收:同时,还可能在昆虫消化道内诱发病灶,促进消化道内细菌繁殖,危害病虫本身。
1.豌豆外源凝集素(Pea Lectin)基因它是一类不含内含子的单拷贝基因,其初始产物是一个25KD的前体蛋白,该前体被转运到内质网后裂解产生成熟外源凝集素的(和(亚基,再经进一步修饰形成豌豆组织中不同类型的同源异型凝集素。昆虫饲喂实验P-Lec能抑制豇豆象的生长。目前,已成功地将P—Lec基因导入烟草和马铃薯,抗虫效果明显。
2.麦胚外源凝集素(Wheat Geam Aggrutinin,WGA)基因这是第一个分离出来的谷类凝集素,它能特异的结合N一乙酰葡糖胺和几丁质。Maddock等针对麦胚凝集素基因的特点,用PCR方法进行了修饰,转基因植株对欧洲玉米螟表现出良好的抗虫效果。
3.雪花莲外源凝集素(Snowdrop Lectin,GNA)基因 最新的研究表明,雪花莲外源凝集素对稻褐飞虱有毒性作用,GNA还能抑制桃蚜的生长,而蛋白酶抑制剂和其他外源凝集素对此没有效果。
四、利用淀粉酶抑制剂基因
淀粉酶抑制剂基因((-Amylase 1nhibitor,(A1)在植物界中普遍存在,尤其是在禾谷类作物和豆科植物种子中,它的杀虫机理在于其抑制昆虫消化道内(-淀粉酶的活性,使昆虫食入的淀粉无法正常消化水解,阻断主要能量来源。同时也会刺激昆虫消化腺过量分泌,通过神经系统的反馈,使昆虫产生厌食反应,最终导致非正常发育或死亡。 Gutierrez等曾利用从小麦和大麦中纯化的(AI对螟虫类、禾谷蚜虫类、蝽类、谷仓虫类、马铃薯甲虫等害虫的消化酶进行抑制了实验。
迄今为止,小麦和大麦中已有多种(AI基因或cDNA被克隆,Altabe11a等把菜豆(AI编码区和种子特异性表达的蚕豆植物凝集素基因及其调控区融合在一起,插入到Ti质粒表达载体中,转化烟草,发现(AI在转基因烟草中能够准确、稳定的表达,并在种子发育中积累。
五、利用核糖体灭活蛋白基因
核糖体灭活蛋白(Ribosome inactive protein,RIP)是来自植物的一类蛋白毒素。它作用于真核细胞的核糖体,通过水解核糖体RNA上特异位点结合的碱基,抑制靶细胞的蛋自质合成,从而使核糖体失活。RIP不灭活自身的核糖体,却能特异作用于亲缘关系较远的种类。1992年Schell等将受控于伤诱导型大麦的RIR cDNA导人烟草,获得了抗病原菌的重组植株。
除上述介绍的植物抗虫基因外,还有几丁质酶(Chitinase)基因、豌豆脂肪氧化酶(Pea lipoxygenase)基因等也与杭虫性有关。几丁质酶能催化水解几丁质,这是昆虫体壁的主要结构成分,从而破坏了昆虫肠上皮保护层,导致虫体消化道的损伤;碗豆脂肪氧化酶对稻飞虱有一定的毒性作用。






